Trafikstyrelsen blev oprettet 1. juli 2003 med det formål at myndighedsopgaver vedrørende danske jernbaner kunne samles et sted.
I første fase overførtes fra Banestyrelsen den såkaldte sektorplanafdeling med Ulrik Winge i spidsen. Det var samtidig blevet besluttet at Jernbanetilsynet og dets opgaver og personale - bortset fra Havariundersøgelser - skulle overføres til Trafikstyrelsen. Dette skete pr. 1. juli 2004.
Pr. 15. april 2010 blev Færdselsstyrelsen fusioneret med Trafikstyrelsen og pr. 1. november 2010 blev Statens Luftfartsvæsen også fusioneret med Trafikstyrelsen.
Både Banestyrelsens Ulrik Winge og Jernbanetilsynets direktør Flemming Lund bejlede til direktørposten i den nye Trafikstyrelse. Alt tegnede til at Flemming Lund umiddelbart syntes velplaceret til at overtage direktørposten, men han var næppe alle parters favorit (hverken jernbanebranchen eller departementet virkede tilfredse med hans indsat som chef for Jernbanetilsynet) hvorfor jobbet kunne gå til Ulrik Winge, med Flemming Lund som sikkerhedschef.
Måske for at løse denne knude udpegedes i sidste øjeblik Banestyrelsen administrerende direktør Jens Andersen til posten. Han blev i 2006 efterfulgt af den tidligere afdelingschef i Trafikministeriet, Per Jacobsen.
Da Per Jacobsen 1. juni 2008 blev chef for Vejdirektoratet tiltrådte Færdselsstyrelsens Carsten Falk Hansen som chef for Trafikstyrelsen.
I efteråret 2004 ansatte Trafikstyrelsen Peter Sloth som sikkerhedschef. Han, der kom fra Københavns Miljøkontrol, havde intet kendskab til jernbaner, jernbaneteknik endsige jernbanesikkerhed. En del af de i Trafikstyrelsen få jernbanesikkerhedsmæssigt kompetente jernbanesikkerhedsmedarbejdere fra Jernbanetilsynet er efterhånden rejst fra styrelsen og i vid udstrækning erstattet af medarbejdere uden væsentlig jernbanesikkerhedsmæssig indsigt. af medarbejdere på samme jernbanesikkerhedsmæssige vidensniveau som sikkerhedschefen. Pr. 30. maj 2007 forlod Peter Sloth Trafikstyrelsen til fordel for en stilling som centerchef for Dansk Polarcenter.
Frem til 30. oktober 2004 var fungerende sikkerhedsdirektør Leif Funch også uden jernbane- hhv jernbanesikkerhedsmæssig baggrund.
Den nye sikkerhedsdirektør Jesper Rasmussen, der tiltrådte pr. 1. november 2007, synes også uden indsigt i jernbanesikkerhedsmæssige forhold.
Trafikstyrelsens Center for Jernbane (fra 2011) er forankret hos Jesper Rasmussen og ledes af 2 kontorchefer, Leif Funch for tilsyn og rullende materiel og cand.scient.pol. Lise Aaen Kobberholm for godkendelser og regler.